摘要

氧化石墨烯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但關(guān)于GO如何與細(xì)胞膜或模型系統(tǒng)相互作用的信息仍然非常有限。當(dāng)GO與脂質(zhì)相互作用時(shí)，它是如何定位自身的還不清楚。在本研究中，朗繆爾單層技術(shù)應(yīng)用于空氣中?研究GO和脂質(zhì)模型之間相互作用的性質(zhì)和方向的水/水界面。故意選擇具有相同18碳烷基鏈但不同電荷頭基的五種脂質(zhì)（DODAB、DSEPC、DSPC、DSPA和SA），以合理化可能的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種相互作用是由極性頭群和GO之間的靜電相互作用決定的。GO可以并入帶正電的脂質(zhì)DODAB和DSEPC的單層，但不能并入帶中性或帶負(fù)電的脂質(zhì)（DSPC、DSPA和SA）。將GO注入荷正電脂質(zhì)DODAB和DSEPC單層下方的亞相時(shí)，觀察到不同的表面壓力行為。提出了一個(gè)“邊入”而不是“面入”的取向模型來(lái)解釋GO在DODAB單分子膜上的吸附。

引言

石墨烯是一種單原子厚的sp2雜化碳原子平面片，由于其新穎的光學(xué)、機(jī)械、電子學(xué)、熱學(xué)和生物學(xué)特性，近年來(lái)在各種研究和應(yīng)用中引起了極大的關(guān)注。1,2氧化石墨烯（GO）具有與石墨烯類似的原子薄結(jié)構(gòu)，但具有大量含氧官能團(tuán)，例如邊緣的羧基和基面上的羥基和環(huán)氧基。1 GO由于其特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)，例如低成本的制造工藝、豐富的膠體性質(zhì)、高吸附性和通用熒光猝滅，在生物傳感和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了優(yōu)越的應(yīng)用。3.?6過(guò)去幾年中，GO或功能化GO作為一種有效的方式，將生物活性肽、蛋白質(zhì)、核酸等治療分子輸送到抗癌藥物中，取得了巨大進(jìn)展。4,7,8 GO也可用于生物傳感，3,9成像，10?12實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白酶活性，13,14和近紅外光熱治療癌癥和阿爾茨海默病。15?17

GO在生物系統(tǒng)中的應(yīng)用需要解決GO和細(xì)胞成分（如膜）之間可能存在的相互作用。膜是自然的二維屏障，將細(xì)胞的內(nèi)部環(huán)境與外部環(huán)境物理隔離。磷脂作為細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分，參與各種生物反應(yīng)，如細(xì)胞粘附、離子電導(dǎo)率、疾病相關(guān)反應(yīng)以及信號(hào)和物質(zhì)的傳輸。18之前的研究已經(jīng)報(bào)道GO可以應(yīng)用于細(xì)胞成像以及藥物和基因傳遞，表明它可能進(jìn)入細(xì)胞。8,10,11但是關(guān)于GO如何與細(xì)胞膜或模型系統(tǒng)相互作用的研究仍然非常有限。19關(guān)于GO的細(xì)胞毒性及其進(jìn)入細(xì)胞膜的方式也得到了不一致的結(jié)果。20,21此外，與球形或管狀納米材料相比，GO是一個(gè)非常薄的層(～1 nm），具有較大的表面積和不規(guī)則形狀。1當(dāng)GO與細(xì)胞膜相互作用時(shí)，它是如何定位自身的尚不清楚。因此，了解GO和各種脂質(zhì)模型之間相互作用的性質(zhì)至關(guān)重要。這些知識(shí)可以為GO在生物和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的未來(lái)應(yīng)用提供進(jìn)一步的信息。

除了GO在生物傳感和生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用外，使用GO和其他一些組件構(gòu)建和組織介觀或宏觀定義良好的復(fù)合材料已被證明是制備電子器件的簡(jiǎn)單而有用的方法，例如超級(jí)電容器電極、導(dǎo)電聚合物和場(chǎng)效應(yīng)器件。22?24因此，理解和操縱GO和復(fù)合材料中其他組件之間的相互作用、方向和結(jié)構(gòu)控制對(duì)于潛在的制造和應(yīng)用至關(guān)重要。

朗繆爾單層和朗繆爾?空氣中的Blodgett（LB）膜?水/水界面是典型的二維表面化學(xué)方法，廣泛應(yīng)用于空氣中兩親分子的結(jié)構(gòu)和性能研究?水/水界面，如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。25?27這些方法的一個(gè)顯著特點(diǎn)是從分子水平對(duì)層結(jié)構(gòu)進(jìn)行內(nèi)在和精確的控制。由于GO薄片邊緣的羧基脫質(zhì)子化，帶負(fù)電的GO和帶電荷的脂質(zhì)之間預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)生22,28靜電相互作用。空氣?水/水界面有望成為研究脂質(zhì)和GO之間相互作用的理想場(chǎng)所，因?yàn)閮捎H性脂質(zhì)很容易在界面上定向，極性/帶電基團(tuán)合并在親水水相中，而非極性部分朝向空氣相。

在本研究中，為了理解和定義GO和具有不同頭群的脂質(zhì)模型之間相互作用的性質(zhì)和方向，在空氣中應(yīng)用了Langmuir單層技術(shù)?表征水/水界面的性質(zhì)，如分子堆積、吸附和偶極矩。選擇具有相同烷基鏈長(zhǎng)度（18個(gè)碳）但不同電荷和頭基的五種脂質(zhì)來(lái)合理化可能的相互作用。本研究中使用的脂質(zhì)的所有烷基都有目的地選擇為具有18個(gè)碳鏈，以消除末端烷基的可能影響，如圖1所示?用原子力顯微鏡（AFM）將Blodgett薄膜轉(zhuǎn)移到基底上，進(jìn)一步表征單層的形貌。

方案1.脂質(zhì)和氧化石墨烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)部分

正電荷脂質(zhì)二十八烷基二甲基溴化銨（DODAB）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿氯化鹽（DSEPC）、中性電荷兩性脂質(zhì)1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DSPC）和負(fù)電荷脂質(zhì)1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸鈉鹽（DSPA）購(gòu)自Avanti Polar Lipides（Alabaster，AL）。硬脂酸（SA）購(gòu)自SigmaAldrich（密蘇里州圣路易斯）。由于頭部基團(tuán)中存在陰離子磷酸鹽和陽(yáng)離子季銨中心，DSPC帶中性電荷，如方案1c所示。由于羧基脫質(zhì)子化，SA被認(rèn)為是帶負(fù)電的分子。所有這些脂質(zhì)在非極性尾部都有18個(gè)碳鏈烷基。光譜級(jí)氯仿和甲醇來(lái)自MP Biomedicals（Solon，OH）。單層GO購(gòu)自ACS Material LLC（馬薩諸塞州梅德福德）。所有這些化學(xué)品均未經(jīng)任何進(jìn)一步凈化。化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。實(shí)驗(yàn)中使用的去離子水來(lái)自Modulab 2020水凈化系統(tǒng)（德克薩斯州圣安東尼奧）。去離子水的電阻率、表面張力和pH值在20.0±0.5°C時(shí)分別為18 MΩ·cm、72.6 mN/M和5.6。所有實(shí)驗(yàn)均在恒溫20.0±0.5°C、濕度50±1%的潔凈室（1000級(jí)）中進(jìn)行。

通過(guò)向10 mg GO中添加10 mL去離子水，然后在冷水浴中超聲1小時(shí)，獲得1 mg/mL GO水分散體（Branson，1510型，丹伯里，CT）。通過(guò)用去離子水稀釋制備0.01、0.02和0.04 mg/mL GO分散體。我們之前已經(jīng)證明，單層GO是使用相同的材料和程序通過(guò)UV獲得的?可見(jiàn)光譜和原子力顯微鏡（AFM）。6張AFM圖像顯示，去角質(zhì)GO的高度約為1 nm，而橫向尺寸高達(dá)幾百納米。將除DSPA外的每種脂質(zhì)溶解在氯仿中，以獲得約0.3 mg/mL的濃度。少量脂質(zhì)：氯仿溶液（25至45μL）在空氣中逐滴沉積?水或空氣?GO分散（0.01、0.02和0.04 mg/mL）界面，使用100μL注射器（Hamilton Co.，Reno，NV）。由于DSPA不完全溶于氯仿，因此使用氯仿：甲醇：水=65:35:8（體積比）的混合溶劑溶解DSPA。在整個(gè)表面化學(xué)測(cè)量過(guò)程中，使用面積為5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽S（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）。表面壓力用合金絲探頭監(jiān)測(cè)，表面電位用開(kāi)爾文探頭監(jiān)測(cè)。當(dāng)DSEPC參與實(shí)驗(yàn)時(shí)，值得注意的是，使用一塊干凈的薄玻璃片覆蓋兩個(gè)特氟隆勢(shì)壘的內(nèi)表面，以防止DSEPC和特氟隆勢(shì)壘之間的任何相互作用。等待15分鐘，蒸發(fā)揮發(fā)性溶劑，使朗繆爾單層達(dá)到平衡。為了吸附GO到脂質(zhì)Langmuir單層，在將單層壓縮到一定的表面壓力后，在單層下方注入0.6 mL 1 mg/mL GO分散液，使GO達(dá)到0.02 mg/mL，然后在恒定區(qū)域監(jiān)測(cè)表面壓力和表面電位隨時(shí)間的變化。

朗繆爾?Blodgett（LB）薄膜是通過(guò)以1 mm/min的恒定速度從亞相垂直拉出一塊新切割的V-1級(jí)云母片（賓夕法尼亞州哈特菲爾德的電子顯微鏡科學(xué)公司）獲得的。在成像之前，將轉(zhuǎn)移的薄膜在空氣中干燥幾個(gè)小時(shí)。原子力顯微鏡（AFM）圖像是使用安捷倫5420 AFM儀器（加利福尼亞州圣克拉拉）以輕敲模式拍攝的，分辨率為512×512像素。懸臂梁的共振頻率為～170 kHz，典型力常數(shù)為7.5 N/m，無(wú)涂層硅探頭。

結(jié)果和討論

表面壓力?脂質(zhì)在空氣中的面積等溫線?GO水分散體界面。表面壓力定義為純水表面和單層覆蓋表面之間的表面張力降低。它描述了空氣中的分子堆積密度?水或空氣?水界面。表面壓力?面積等溫線是通過(guò)監(jiān)測(cè)表面壓力變化與平均分子面積在恒定溫度下壓縮過(guò)程中獲得的。當(dāng)分子在崩塌前緊密堆積時(shí)，通過(guò)外推表面壓力的線性部分得到的面積?表面壓力為零（如圖1a中的虛線所示）的面積等溫線（固相或液凝聚相）被稱為極限分子面積。29這一重要特征代表了分子緊密堆積在單層中時(shí)所占的平均分子面積。極限分子面積通常由頭基的分子間相互作用和烷基鏈的堆積決定。30

圖1.表面壓力?脂質(zhì)在空氣中的面積等溫線?水或GO分散界面：（a）帶正電的DODAB；（b）帶正電的DSEPC；（c）中性充電DSPC；（d）負(fù)電荷DSPA；（e）帶負(fù)電的SA。請(qǐng)注意，在空氣中未檢測(cè)到表面壓力?進(jìn)入分散界面，不要在界面上分散脂質(zhì)。帶有每個(gè)分子軸面積的虛線截距表示每個(gè)分子的極限面積。

圖1顯示了表面壓力?純水和GO水分散體亞相（0.01、0.02和0.04 mg/mL GO）上帶正電的DODAB（a）和DSEPC（b）、帶中性電荷的DSPC（c）、帶負(fù)電的DSPA（d）和SA（e）的面積等溫線。

值得注意的是，使用0.01、0.02和0.04 mg/mL GO水分散體作為亞相，在界面處未檢測(cè)到表面壓力，而不擴(kuò)散脂質(zhì)（數(shù)據(jù)未顯示），這表明本研究中使用的GO本身的表面活性不足以影響水的表面張力。純水子相上帶正電的DODAB和DSEPC的極限分子面積分別為73和61?2/分子，如圖1a、b中黑色曲線上的虛線所示。這些數(shù)字與之前的研究一致。30?32當(dāng)這兩種脂質(zhì)沉積在空氣中時(shí)?在GO分散界面，隨著亞相GO濃度從0.01增加到0.02到0.04 mg/mL，可以清楚地觀察到極限分子面積的增加。此外，隨著GO濃度的增加，液體凝聚相開(kāi)始于更高的平均分子面積。這一觀察表明，GO可以結(jié)合或吸附到DODAB和DSEPC的單層中，增加平均分子面積。然而，當(dāng)沉積帶中性電荷的脂質(zhì)DSPC、帶負(fù)電的脂質(zhì)DSPA和脂肪酸SA時(shí)，表面壓力?流動(dòng)分散時(shí)的面積等溫線幾乎與純水子相上獲得的等溫線完全相同，如圖1c所示?e、在這三種分子的每種情況下，表面壓力在幾乎相同的平均分子面積下升高，并且極限分子面積也非常相似，盡管在亞相中GO的濃度不同。這些觀察結(jié)果表明，GO不能并入或吸附到DSPC、DSPA或SA的單層中。界面和亞相的GO的存在對(duì)這些分子的單層形成沒(méi)有任何影響。由于細(xì)胞膜中的磷脂帶負(fù)電荷或中性電荷，細(xì)胞可能將GO攝取到膜中不應(yīng)是由于GO和磷脂之間的直接化學(xué)相互作用，而是通過(guò)生物過(guò)程，如內(nèi)吞作用。8,33

圖1清楚地表明，具有不同電荷的頭部基團(tuán)對(duì)脂質(zhì)和GO之間的相互作用有著深遠(yuǎn)的影響。人們認(rèn)為疏水性尾部基團(tuán)不參與這種相互作用。這是因?yàn)?8碳疏水尾應(yīng)朝向疏水空氣相。即使尾巴可以與GO在空中接觸?在沉積后的水界面上，在壓縮過(guò)程中未觀察到對(duì)DSPC、DSPA和SA等溫線的提升面積或極限分子面積的影響。特別值得注意的是，DSEPC、DSPC和DSPA具有完全相同的1,2-二硬脂酰-sn-甘油基團(tuán)，只是與頭部基團(tuán)不同，如方案1b所示?d、因此，控制GO和脂質(zhì)相互作用的因素是頭部。帶正電的頭基（銨和乙酰膽堿）與GO帶負(fù)電的羧基具有強(qiáng)大的靜電吸引力，導(dǎo)致GO并入單層。由于不利于靜電相互作用，帶中性電荷的頭基（磷酸膽堿）或帶負(fù)電荷的頭基（磷酸和羧基）不吸附GO。此外，這些帶中性電荷和帶負(fù)電的頭群似乎可以將圍棋從空中擊退?GO色散界面。這解釋了為什么這些脂質(zhì)在GO分散上的等溫線與在純水亞相上的等溫線幾乎完全相同。因此，我們將在下面的討論中重點(diǎn)討論GO和DODAB以及DSEPC之間的相互作用。